jueves, 15 de octubre de 2009

Módulo IV Introduccion a la Hematologia

Dr. Limber Jaldin
Lic. Hebert Nina

Práctica Nº 1
Componentes y fisiología de la sangre

Objetivo: Describir la composición y fisiología de la sangre.

Antecedentes: La sangre es una suspensión de células en un medio líquido llamado plasma que circula por el sistema vascular y sistema capilar, gracias a las contracciones del corazón, la retracción de los grandes vasos, el movimiento muscular y la fuerza de la gravedad.

En la sangre se pueden diferenciar: una fracción líquida llamada plasma y una fracción sólida, que está constituida por células sanguíneas.

El plasma, constituye aproximadamente el 55% del volumen total de la sangre, está formado por un 90 % de agua, en la que se encuentran disueltas diversas sustancias nutritivas, de recambio metabólico o de desecho celular, entre ellas se encuentran: principios inmediatos, enzimas, electrolitos, gases y derivados del catabolismo celular, el componente más abundante son las proteínas que cumplen diferentes funciones: catálisis (enzimas), defensa (inmunoglobulinas y complemento), transporte (transcobalamina), endocrina (hormonas), y hemostasia (factores de coagulación).

A continuación se pueden observar algunos de los componentes del plasma:

• Proteínas totales: 6,2 - 8,5 g%
O Albúminas: 3,5 - 5,5 g%
O Globulinas: 2,5 - 4,1 g%
o Fibrinógeno: 200 - 400 mg%

• Glucosa: 70 - 110 mg%

• Lípidos:
o Colesterol: 140 - 200 mg%
o Triglicéridos: 35 - 150 mg%


• Productos derivados del metabolismo:
o Urea: 17 - 42 mg%
o Creatinina: 0,8 - 1,4 mg%
o Acido úrico: (H) 3,5 - 7,2 mg%
o Bilirrubina Total: 0,3 - 1,0 mg%

• Electrolitos:
o Calcio: 9,0 - 11 mg%
o Sodio: 136 - 145 mEq/l
o Potasio: 3,5 - 5,0 mEq/l

El plasma es la fracción líquida que se obtiene por centrifugación de sangre mezclada con
anticoagulante, variando el aspecto macroscópico del mismo según las condiciones y patología del individuo, siendo amarillo pajizo en condiciones normales, tomando otras tonalidades en casos patológicos, como amarillo intenso en casos de hiperbilirrubinemia, blanquecino o lechoso por la presencia de quilomicrones y fundamentalmente rojizo en caso de hemólisis de la muestra por errores en la extracción de la misma o del proceso de separación durante la centrifugación.

El suero se puede definir como el mismo plasma, pero que carece de fibrinógeno y algunos factores de la coagulación, siendo su aspecto de color amarillento transparente. Se obtiene al centrifugar una muestra de sangre coagulada, o bien en reposo tras retracción del coágulo sanguíneo.

El 45 % restante del volumen está formado por células sanguíneas que, igual que los componentes plasmáticos, se encuentran sometidas a un proceso continuo de renovación.
Estas células son de tres tipos: eritrocitos, leucocitos y plaquetas, y todas ellas tienen su origen en una única célula pluripotente o célula madre, situada en el tejido hematopoyético de la médula ósea. Una vez en la circulación y después de un cierto tiempo, las células son eliminadas por los macrófagos del sistema mononuclear fagocítico de la propia médula ósea, el bazo y el hígado.

El recambio celular sanguíneo se mantiene gracias al equilibrio entre la formación de células por la médula ósea (hematopoyesis) y su eliminación a nivel del sistema mononuclear fagocítico, (muerte celular).

Los eritrocitos carecen de núcleo y organelas citoplasmáticas y, su única misión es el transporte de la hemoglobina a lo largo del sistema vascular con el fin de garantizar la oxigenación de los tejidos.

Los leucocitos se clasifican en tres sub-poblaciones: polimorfonucleares, linfocitos y monocitos.

Todos ellos tienen función de defensa. Los polimorfonucleares la realizan mediante la fagocitosis o ingestión de sustancias extrañas al organismo, los linfocitos mediante la inmunidad produciendo anticuerpos contra las sustancias extrañas (inmunidad humoral) o actuando directamente sobre las mismas (inmunidad celular). Los monocitos tienen esencialmente función fagocítica (macrófagos), pero intervienen también en el proceso de inmunidad modulando algunas de sus etapas.

Las plaquetas, tienen como misión prevenir la extravasación de sangre a nivel del sistema capilar y contribuir a la coagulación sanguínea en caso de hemorragia.

Gracias a la circulación de la sangre, las células sanguíneas pueden realizar las importantes funciones ya descritas y el plasma puede contribuir al metabolismo de los tejidos mediante la adecuada distribución de sustancias nutritivas a las células, la recolección de productos de desecho resultado del metabolismo celular, la regulación del pH y el transporte de gases respiratorios (oxigeno y dióxido de carbono).

La sangre puede tener diferente color, según sea su procedencia. Así, la sangre venosa es de color rojo oscuro, mientras que la sangre arterial es de color escarlata al ser más oxigenada.

En el adulto normal, el volumen total de sangre o volemia es aproximadamente equivalente al 7-8% del peso corporal, la sangre se desplaza aproximadamente a una velocidad de 30 cm. /seg. con un tiempo de circulación completa de 20 seg. El pH sanguíneo fluctúa normalmente entre 7.36 a 7.44, se habla de acidosis cuando el Ph desciende de 7.36 y alcalosis cuando se eleva sobre 7.44.


Práctica Nº 2
HEMATOCRITO
Es la relación existente entre el volumen ocupado por los hematíes (también de su forma y tamaño) y el ocupado por la sangre total.

El análisis del hematocrito se realiza normalmente en un estudio completo de la hematimetría, con el recuento de glóbulos rojos o hematíes. Se expresa en forma de porcentaje.

Fundamento. Se basa en centrifugar, un volumen conocido de sangre (en un capilar,) a una velocidad constante de (5000 a 10000 rpm), por un periodo de 10 minutos, en el cual se separan los distintos componentes de la sangre de acuerdo a la densidad.

Material y Equipo:
Centrífuga de Microhematocrito (5.000 – 10.000 G).
Tubos capilares de puntos de fusión (75mm cm de longitud x 1mm de calibre interior) con ó sin heparina.
Plastilina.
Escala de lectura o regla.
Pipetas Pasteur.
Procedimiento: (microhematocrito)
Si se trabaja con muestra venosa (anticoagulante EDTA), esta se debe mezclar por inversión de 10 a 20 veces antes de proceder con la técnica. Si se toma muestra capilar, tras efectuar la punción capilar se eliminan las tres primeras gotas de sangre y se procede de la misma forma.
Llenar el tubo por capilaridad, ya sea de una punción capilar se utiliza los capilares con ranura roja y si es venosa los tubos capilar con ranura de color azul.
Una vez llenado hasta las 2/3 a ¾ parte de su capacidad se sella en el extremo inferior con plastilina, mínimo 2 capilares por paciente.
Colocar en la microcentrífuga 5 minutos de 10.000 a 12.000 r.p.m.
Luego realizamos la lectura: sobre un ábaco colocamos el capilar, haciendo coincidir el cero con el comienzo de la columna hemática y el 100 con el nivel superior del plasma. La altura de la columna roja indica el volumen.
Factores que Interfieren:
La velocidad de centrifugación y el tiempo.
La presencia de coágulo en la muestra altera los resultados.
El exceso de anticoagulante ya que diluye la muestra.
El uso de anticoagulante inapropiado, algunos son tóxicos como los oxalatos.
Recomendaciones:
El hematocrito por métodos automatizados electrónicos es 3 % más bajo que el micrométodo.
El torniquete aplicado por más de 1 minuto da un falso hematocrito aumentado en 2,5 a 5 %.
La concentración de EDTA debe ser óptima ya que si es sobre 2 mg/ml da hematocrito falsamente bajo.
Muestras con coágulo invalidan el proceso.
Mezcla inadecuada antes de cargar los tubos, en especial cuando hay VES (velocidad de eritrosedimentación globular) muy acelerada.
Se acepta máximo 3 % de diferencia entre las muestras pareadas.
Debe controlarse la velocidad y tiempo adecuados.
Debe usarse capilares de diámetro uniforme.
No usar calor para sellar el capilar.
Es importante notar las particularidades de color del plasma y la cantidad de la placa leucocitaria.
Esta última correlacionarla con el recuento leucocitario.
La toma con capilar heparinizado no debe presentar burbujas.
Considerar que el hematocrito por punción capilar es más bajo (aprox. 2 mm.).

Al valorar el hematocrito en ciertas condiciones patológicas, debe tenerse siempre en cuenta, no obstante, e independientemente de la concentración de hemoglobina, su valor puede variar también y a veces de manera importante con el valor del volumen plasmático. Así un descenso del volumen plasmático dará lugar aun falso aumento del hematocrito por hemoconcentraciones, mientras que un aumento producirá una falsa anemia por hemodilución. Por ello, el hematocrito sólo podrá ser adecuadamente interpretado cuando exista la certeza de que el volumen plasmático es normal.

Otro hecho importante que hay que tener en cuenta es que el hematocrito , que normalmente se determina mediante centrifugación de sangre total, no corresponde al que existe realmente en cualquier territorio vascular del organismo, sino sólo al del empleado para realizar la extracción sanguíneo .Así el hematocrito de sangre capilar es superior al que se obtiene a partir de sangre venosa.

Valores Normales:
El hematocrito al igual que el número de hematíes y la concentración de hemoglobina varía con la edad y el sexo.
El valor del Hto. Disminuye siempre que lo hace la concentración de hemoglobina. El aumento del Hto. Se corresponde también con un aumento de la concentración de hemoglobina.

Recién nacido
44 a 56 %
A los 3 meses
32 a 44 %
Al año de edad
36 a 41 %
Entre los 3 y 5 años
36 a 43 %
De los 5 a los 15 años
37 a 45 %
Hombre adulto
40 a 52 %
Mujer adulta
37 a 47 %
Mujeres embarazadas
34 a 44 %

Práctica Nº 3
HEMOGLOBINA

La determinación de la hemoglobina en sangre es de gran importancia en el diagnostico de las anemias. Por ello se exige que el método utilizado sea preciso y fiable.
Método: de la cianmetahemoglobina.
Fundamento: Se basa en la transformación de la hemoglobina en cianmetahemoglobina mediante los siguientes pasos:
En primer lugar el Fe++ de la hemoglobina presente en la muestra, en presencia de ferrocianuro potásico, se oxida a Fe+++ dando lugar a la metahemoglobina.
Posteriormente, y en presencia de cianuro potásico, la metahemoglobina pasa a cianmetahemoglobina. Éste es un compuesto estable, de color rojo con un pico de absorción máximo a 540 nm y cuya concentración puede ser determinada por métodos colorimétricos empleando un patrón de concentración conocida.
Todo los hemocromógenos, a excepción de la sulfohemoglobina, reacciona completamente a los 3 minutos.
La muestra puede ser, de origen capilar ó venosa, si es capilar se debe seguir la técnica usual rápidamente para evitar la coagulación, descartando las dos primeras gotas después de la toma de muestra. Si es muestra venosa, debe adicionarse anticoagulante concentrado o desecado (liofilizado). Si es sangre venosa será con anticoagulante heparina o EDTA.
Material y Equipo:
v Espectrofotómetro (540 nm)
v Micropipeta de 20µl ó 0.02ml de capacidad.
v Pipetas volumétricas de 5ml.
v Cubetas del espectrofotómetro.
v Recipientes de vidrio para contener el reactivo y la muestra.
v Frasco de vidrio color caramelo.
v Baño maria
v Reloj.
Reactivos:
Solución de Drabkin a preparar: Ferrocianuro de potasio, cianuro potásico, Conservantes y estabilizantes.
Procedimiento:
v Homogeneizar la muestra, antes de usar.
v En tubos de ensayos debidamente rotulados desconocidos (D), Se coloca 5ml del reactivo de Drabkin. Marcar otros de los tubos como blanco (B) ya que este contendrá sólo reactivo y otro como stándard (S).
v Con la micropipeta, agregar 20 µl de la muestra, limpiando la parte externa con papel absorbente.
v Enjuagar 3 veces en el propio reactivo y con la misma pipeta mezclar.
v Luego dejar en reposo por tres minutos leer en espectrofotómetro (540nm) ó foto colorímetro (520-550nm) la densidad óptica (D.O.) del desconocido, que se compara con la (D: O) del stándart en la curva de calibración, que permitirá la determinación de la concentración de hemoglobina por interpolación. Llevando el aparato acero con el reactivo (B).
El color de la reacción es estable, al menos 24horas por lo que la absorbancia (A) puede ser leída en ese lapso.
Los puntos críticos del procedimiento. Asegúrese de tener los volúmenes exactos y de dejar el tiempo necesario según el procedimiento.

Cálculos de los resultados:

Hb gr/dl = D x Factor
Factor = . [ Stándart] . gr/dl =
D.O. del St.

Recomendaciones:
v La estasis venosa producida por el empleo del torniquete superior a 1 minuto produce aumento de la concentración de hemoglobina.
v La muestra debe mezclarse adecuadamente.
v Evitar los errores de pipeteo o dilución..
v Tener precaución en la preparación y manejo del reactivo de Drabkin, ya que posee cianuro que es muy tóxico.
Factores que Interfieren:

v Presencia de coágulo en la muestra, falta de homogeneizar la muestra.
v Muestra hemolizada.
v Material mal lavado

Valores Normales:

Niños de 6 meses a 6 años
11 g./dl
Niños de 6 a 14 años
12 g./dl
Varones adultos
13-17 g/dl
Mujer adulta, no embarazada
12-14 g/dl
Mujer adulta, embarazada
11 g./dl
Recién nacidos
15-20 g/dl
Ancianos
12-14 g/dl

Práctica Nº 4
Índices eritrocitarios

Objetivo: Determinar los índices eritrocitarios mediante fórmulas matemáticas.

Antecedentes: En el año 1930 M.M. Wintrobe diseñó un sistema para aprovechar, mejor la
información proporcionada por el hemograma relacionando la concentración de hemoglobina, con la de eritrocitos y el hematocrito a través de los índices eritrocitarios.

Estos índices permiten conocer el valor medio del tamaño del eritrocito o VCM, del contenido individual de hemoglobina o HbCM y la concentración de hemoglobina por litro de eritrocitos o CHbCM.

La práctica clínica ha demostrado que los índices eritrocitarios y en especial el VCM, son hoy prácticamente imprescindibles para realizar el diagnóstico etiológico y la clasificación de las anemias.

Volumen corpuscular medio:

El VCM o valor medio del volumen de cada eritrocito se calcula a partir del Hematocrito y de la concentración de eritrocitos mediante la siguiente fórmula:

Valores de referencia: 76 – 96 femtolitros (fL)

Ejemplo. Si el hematocrito es 0,45, quiere decir que 1 litro de sangre posee 0,45 L de eritrocitos. Si la concentración de eritrocitos es 5 x10 12 /L, el volumen ocupado por cada uno de ellos será:

VCM= 0,45 / 5x10 12 = 90 x 10 -15 L, o sea 90 femtolitros (fL).

Hemoglobina corpuscular media:

La HbCM o valor medio del contenido de hemoglobina por eritrocito se determina mediante el cociente entre la concentración de hemoglobina (g/L) y la de eritrocitos (L)

Valores de referencia: 27 – 32 picogramos (pg)

Ejemplo. Si una muestra de sangre tiene 150 g/L de hemoglobina y 5 x10 12 /L de eritrocitos, la hemoglobina de cada eritrocito será:

Concentración corpuscular media de hemoglobina:

La CHbCM corresponde a la concentración de hemoglobina por cada litro (L) de eritrocitos (sin consideración del plasma) y se calcula a partir de la concentración de hemoglobina (g/L) y el hematocrito.

Valores de referencia: 320 – 360 (g/L)

Ejemplo. Si una muestra de sangre contiene 150 g/L de hemoglobina y el hematocrito es 0,45, la CHbCM será:

Interpretación: El VCM permite diferenciar entre anemia microcítica con un VCM menor a 76, macrocítica mayor a 96 y normocítica con un VCM entre 76-96 fL. Una anemia microcítica es muy probablemente ferropénica y una anemia macrocítica es muy probablemente megaloblástica.

La HbCM y la CHbCM son los índices eritrocitarios relacionados con la concentración de
Hemoglobina.

Análisis electrónico de los índices eritrocitarios:

En 1956 Coulter introdujo por primera vez el concepto de la determinación del tamaño de las células suspendidas en medio líquido mediante el método de la impedancia eléctrica. Este descubrimiento hizo posible el recuento de cualquier tipo de células sanguínea así como la determinación de su tamaño de forma rápida (varios miles de células por segundo) y fiable.


Práctica Nº 5
VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR

Se basa en la relación existente entre factores corpusculares (elementos formes) y plasmáticos que hacen que la columna de sangre, colocada en la pipeta de Westergren en una posición vertical, los hematíes descienden lentamente en relación al tiempo, por que los hematíes son más pesados que el plasma en el que se hallan suspendidos, depende tmbien del numero, tamaño y forma del eritrocito, así como de factores plasmáticos que alteran la carga electonegativa de los hematíes en su superficie. Es de utilidad, ante procesos de naturaleza sistémicos, orgánicos. Como ser inflamación (reactantes de fase aguda de naturaleza plasmática) así como por la cantidad de elementos formes (eritrocitos como factores corpusculares).
Material:
Pipetas de Westergren.
Soporte para pipetas de Westergren.
Reloj o cronómetro.
El anticoagulante a utilizar debe ser citrato sódico acuoso al 3,8 % ó 109mmol/l (3,2 %) en forma dihidratada Na3C6H5O7 2H2O.
Procedimientos:
Extraer sangre venosa y mezclarla con la solución anticoagulante acuoso, respetando la proporción de la sangre de 4 volúmenes y el anticoagulante en 1 volumen.
La determinación debe realizarse dentro de las 2 horas de tomada la muestra ó bien dentro de 6 horas, que implica la conservación de la muestra a 4º C, mezclando previamente la sangre y anticoagulante, se elimina la muestra si la misma aglutina.
La pipeta de Westergreen se la llena hasta la señal cero, para ello se prefiere la succión mecánico.
Se coloca el tubo de Westergreen con la muestra, en un bastidor especial, con unos sujetadores de muelle que mantienen el extremo inferior de la pipeta fuertemente
sujetando contra una base de goma en posición estrictamente vertical a 90º, ya que un ángulo de 3º con la verticalidad puede acelerar la eritrosedimentación en un 30 %. Tomando en cuenta la temperatura promedio de (18 a 25º C), sin exponer el tubo a vibraciones o radiación solar.
Se deja en reposo sin mover el tubo en el soporte durante 60 minutos para leer luego el resultado que se expresa en mm/h.
Factores que Interfieren:
Anticoagulante que diluyen la muestra aceleran la VCG.
Los tubos largos aceleran la sedimentación así como los de diámetro superior a 3mm.
· temperatura ambiente superior a 30º C aceleran la sedimentación.
· La pipeta mal sujetada.
Recomendaciones:
No debe emplearse otro anticoagulante.
Se debe respetar la proporción adecuada de anticoagulante con muestra.
Tomar encuenta la temperatura ambiente debe estar entre 18 – 23º C.
Evitar incluir en la lectura la capa leucoplaquetaria por que es incorrecto.
Es bueno apreciar las particularidades del color del plasma, su turbidez, así como las características de la capa leucocitaria para correlacionar con otras pruebas ó diagnósticos. Evitar que ingresen burbujas a la pipeta cargada.
Es preferible realizar el procedimiento con las condiciones indicadas antes que realizar el índice de Katz (2 horas de lectura).
La gradilla con las pipetas cargadas debe estar en posición vertical (estricta).
El procedimiento acelerado (a 45º de inclinación por 15 minutos) solo debe emplearse en casos de extrema urgencia (error del 30%) y debe informarse por escrito si se realizo este procedimiento.
Es recomendable el empleo de propipeta para el cargado.
Valores Normales:
Hombres = 0-15mm/h
Mujeres = 0-20mm/h
Niños = 0-10mm/h

Práctica Nº 6
RECUENTOS DE LEUCOCITOS

Objetivo:
Es cuantificar a los leucocitos por milímetro cúbico, o sea determinar la concentración de cada uno de ellos en un milímetro cúbico de sangre.
Fundamento:
Se basa en que la solución ácida, hemoliza a los hematíes, pero no altera los leucocitos o células nucleadas, se evidencia el numero de las mismas en una cantidad determinada de sangre.
Procedimiento:
Se recomienda sangre venosa, ya que los valores de los GB están disminuidos en la sangre capilar. La sangre venosa debe tener EDTA o mezcla de Wintrobe.
Material – Equipo:
v Micropipeta.
v Cubrecámara.
v Cánula de succión.
v Microscopio óptico.
v Contómetro.
v Hemacitómetro (cámara de Neubauer preferentemente con fondo brillante).
v Tubo de ensayo.

Reactivos:
El líquido que más se utiliza es la solución de Turk y se compone:

v Ácido acético glacial. 1 – 2 ml.
v Violeta de genciana ó azul de metileno al 1 %. 1 ml.
v Agua destilada. 100 ml.
Técnicas:

En tubo: Método recomendado:

v Depositar 1.9 ml de solución de Turk en un tubo de ensayo.
v Mazclando la muestra absorver 20 µl, limpiar la superficie externa de la puntera (tip) y depocitarla en la solucion, mezclar cuidadosamente.
v Se logra una dilución final de 1:20.
v Luego se procede cargar a la camara de Neubauer, dejando un instante, luego procede a contar los leucocitos.

Se efectua el recuento en los cuadrados grandes de las cuatro esquinas (1 mm2 cada uno) se incluyen las celulas que estan dentro de estos y las que están en contacto con la primera línea.
Seegún el No de GB contados se calcula:
No de GB x 20 x 10 = GB x 50.
4
Donde:
No GB = numero de GB contados en los 4 cuadrados.
20 = inversa o el título de la dilución 1:20
10 = inversa o la corrección de la profundidad de la cámara (0.1), para llevar a 1mm3.
4 = no de cuadrantes.

Recomendaciones:

v Recolección de muestra en condiciones de cianosis.
v Si se practica la punción venosa evitar la compresión exagerada y prolongada.
v Si se practica punción capilar tratar que la sangre fluya en forma espontánea, sin efectuar demasiada presión sobre la zona.
v Pipetas mal calibradas.
v Carga de la cámara con la primera gota de la pipeta.
v Distribución desigual en la cámara.
v Incorrecto ajuste del cubreobjetos.
v Cuenta defectuosa de los elementos.
v Confundir los leucocitos con hematíes en la leucosis.
v Autoaglutinación.
v Presencia de burbujas en la pipeta.
Valores normales:
v Hombre y Mujer adulta: (5.000 a 10.000) por mm3.

v Recién nacidos: 18.100(9.000 a 30.000) por mm3.

v 1 semana: 12.200(5.000 a 21.000) por mm3 .

v 1mes: 10.800 (5.000 a 21.000) por mm3.

v 6 meses: 11.900(6.000 a 17.500) por mm3.

v 1 año: 11.400(6.000 a 17.500) por mm3 .

v 4 años: 9.100(5.500 a 15.500) por mm3.

v 10 años: 8.600(4.500 a 13.500) por mm3.


Práctica Nº 7
RECUENTO DE PLAQUETAS

Las plaquetas son pequeños fragmentos de citoplasma que se han desprendidos de la periferia del magacariocito, de forma ovoideos, sin núcleo, con un diámetro mucho menor que el de los eritrocitos. Los trombocitos o plaquetas se adhieren a la superficie interna de la pared de los vasos sanguíneos en el lugar de la lesión y ocluyen el defecto de la pared vascular. Conforme se destruyen, liberan agentes coagulantes que conducen a la formación local de trombina que ayuda a formar un coágulo, el primer paso en la cicatrización de una herida.
Recuento de plaquetas:
Por método directo en cámara. Para determinar la cantidad de plaquetas en el organismo expresadas en mm3.
Material:
v Micropipetas de 20 y 380 µl.
v Cámara de recuento (Neubauer).
v Microscopio.
v Cubre cámara.
v Tubos de 75 x 12 mm. (plástico).
Reactivos:
Este líquido se conserva indefinidamente en refrigerador entre 2 a 10o C. Oxalato de amonio al1 %. Debe conservarse en refrigerador y filtrarse cuando se utilice.
Procedimiento:
v Se obtiene sangre venosa con EDTA. (mezclar).
v En un tubo efectuar una dilución 1:20.
v En un tubo de plastico colocar 380 µl.del reactivo de plaquetas.
v Con la micropipeta, aspirar 20 µl. de la muestra.
v Limpiar la parte externa de la pipeta.
v Mezclar por un instante.
v Con la ayuda de la micropipeta cargar en la cámara.
v Dejar la cámara en reposo durante 15 minutos en ambiente húmedo (caja de Petri con algodón húmedo).
v El recuento se lo realiza en todo el retículo de GR, las plaquetas se ven redondas refringentes aumentadas de volumen por la hipotonía del diluyente.
v La lectura se realiza con objetivo de 10X o 40X, para su mejor visualización se usa contraste en fase.
Calculo del resultado: multiplicar el No de plaquetas contados en los 25 cuadraditos del retículo central por 1000, el resultado es el número de plaquetas por mm3. El factor resulta de multiplicar la altura de la cámara (10) por la superficie contada 1/16 del total del retículo 16 por el factor de dilución 1/20 es decir 20.
Calculo:
No de plaquetas = No de P. x 400 x 20 x 10 = mm3
80
No …No de P. contados en los 5 cuadraditos.
400…No totales de cuadraditos del cuadrado central (25 X 16).
80….No de cuadraditos contados (5 x 16).
20….Inversa de la dilución.
10….Inversa de la profundidad de la cámara.
Recuento de plaquetas en el film sanguíneo:
Se observa el frotis en la zona destinada al leucograma con objetivo con objetivo 100 X a inmersión, se cuenta el No de plaquetas en 10 campos, con oculares de 10 X, considerando en ese caso que, 100 plaquetas en 10 campos equivalen a 200000 plaquetas x mm3, por tanto una plaqueta por campo equivale a más o menos 20000 plaquetas en el recuento en el hemacitómetro. Se debe considerar como rango de referencia en cada campo de inmersión aproximadamente de 7 a 21 plaquetas. De modo que se puede deducir el siguiente cálculo:
Valores de referencia:
Hombres – mujeres adultos 150.000 – 390.000 mm3.
Recién nacido 100.000 – 300.000 mm3.



PRACTICA Nº 8
Realización de la extensión sanguínea y coloración

Objetivo: Obtener un extendido sanguíneo ideal que permita apreciar la morfología eritocitaria y efectuar el recuento diferencial de leucocitos o fórmula leucocitaria.

Fundamento y generalidades sobre extendidos sanguíneos:

La práctica de una extensión sanguínea es de gran importancia en hematología, ya que muchas hemopatías se diagnostican con sólo observar las características morfológicas de las células circulantes.

La calidad de la extensión debe ser impecable y, debido a que constituye siempre un medio para controlar la presencia de eventuales alteraciones sanguíneas detectadas mediante los autoanalizadores, es muy recomendable realizarla en la misma cabecera del paciente y, a ser posible, con sangre sin anticoagulante. Ello obedece a que tanto el tiempo como la naturaleza del anticoagulante ejercen un efecto directo sobre la morfología celular, induciendo la aparición de artefactos.

Métodos: Para realizar una buena extensión de sangre existen métodos manuales y automatizados.

Realización manual: Se describirá el método de los dos portaobjetos.

Material:

- Jeringa desechable o lanceta.
- Portaobjetos
- Lápiz para identificar

Técnica:
- Colocar una pequeña gota de sangre (aproximadamente 5 uL.) de no más de 3 mm de diámetro sobre la superficie de un portaobjetos a 2 cm aproximadamente de uno de sus extremos.
- Colocar el borde de otro portaobjetos por la parte anterior a la gota de sangre sobre la superficie del primer portaobjetos, formando un ángulo de aproximadamente 45º, y desplazarlo suavemente hacia atrás hasta que alcance la gota de sangre.
- Esperar a que por capilaridad toda la sangre se distribuya de manera uniforme. Es aconsejable que la sangre no llegue a los lados del portaobjetos sobre el que se realizará la extensión.
- Deslizar suavemente y a velocidad moderada un portaobjetos sobre el otro en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida sobre la superficie del primer portaobjetos. El grosor de la extensión sanguínea se puede variar según sea el ángulo que formen entre si ambos portaobjetos. Así, si es superior a 45º, la extensión obtenida será gruesa y corta; por el contrario, si es inferior a 45º, será larga y fina.
- Secado de la extensión a temperatura ambiente y en posición horizontal.

Una buena extensión realizada mediante esta técnica presentará tres áreas de diferente grosor y con distribución también distinta de leucocitos: zona excesivamente gruesa o cabeza, zona excesivamente fina o cola y zona intermedia o cuerpo que es la zona ideal para la observación ya que existe un reparto equilibrado de las células.
Todo el material a emplear debe estar escrupulosamente limpio y desengrasado.

Si se parte de punción digital, debe desecharse siempre la primera gota. Si se parte de punción venosa, la extensión debe hacerse con la máxima rapidez y, a ser posible, antes de mezclar la sangre con el anticoagulante. Si esto es imposible, la extensión debe realizarse siempre dentro de las dos horas de extraída la muestra y empleando siempre EDTA.

Fundamento y generalidades de la tinción de la extensión sanguínea:

Una vez seco el extendido de sangre, debe someterse lo antes posible a un proceso de fijación para ser teñida.

Los métodos empleados para teñir células sanguíneas se basan en el empleo del colorante de Romanowsky, constituido por la mezcla de eosina (colorante ácido) y azul de metileno (colorante básico). El empleo del método de Romanowsky, requiere dos premisas fundamentales:

a) La fijación de la sangre extendida sobre el portaobjetos antes de aplicar el colorante.
b) El empleo, junto a la eosina y el azul de metileno, de derivados por oxidación de este último (metiltionina), que se conocen con el nombre de azures (azur A, azur B y azur C).

Estas sustancias son las responsables de la coloración púrpura de la cromatina leucocitaria y de ciertas granulaciones citoplasmáticas, que por ello se denominan azurófilas. Con ello se consigue distinguir los siguientes aspectos morfológicos de las células:

1. Forma, dimensiones y contorno de las células sanguíneas.
2. Núcleo celular y restos de cromatina (color púrpura).
3. Citoplasma de los linfocitos (color azul).
4. Citoplasma de los monocitos (color grisáceo).
5. Granulaciones de los polimorfonucleares: eosinófilos (color naranja), basófilos (color azul oscuro), neutrófilos (color pardo)
6. Eritrocitos: color rosa pálido.
7. Reticulocitos: color azulado.

Las estructuras celulares que tienen carácter basófilo, captan el color azul y aquellas que presentan carácter acidófilo captan el color rosado.

Tinción de May-Grünwald-Giemsa:

El empleo combinado de estos colorantes se conoce como tinción panóptica de May-Grünwald-Giemsa.

Material:

- Extensión sanguínea seca.
- Solución de colorante Giemsa.
- Solución de colorante May Grünwald

Técnica de Tinción de May-Grünwald-Giemsa:

- Cubrir la extensión sanguínea mediante solución de May Grünwald, durante 1 minuto.
- Lavar la extensión y teñir mediante solución de Giemsa, preparada en una dilución 1:4, dejar 20 minutos.
- Lavar la extensión con abundante agua destilada.
- Secar la extensión al aire. Una vez seca, está lista para la observación microscópica.


PRACTICA Nº 9
Automatización en Hematología

El principio Coulter de medición de volumen y recuentos de partículas se lo debemos a Wallace H. Coulter quien el año 1956 inventó el primer contador automático de células sanguíneas.

Principios del Método

W. Coulter describió su método “El instrumento emplea un sistema de medición no óptico que provee un rango de medición que excede las 6.000 células individuales por segundo con un intervalo de conteo de 15 segundos. Una suspensión de células sanguíneas es pasada a través de un pequeño orificio simultáneamente con una corriente eléctrica. Las células sanguíneas individuales pasando a través del orificio producen un cambio de impedancia (resistencia) en el orificio el cual está determinado por el tamaño de la célula. El sistema cuenta las células individuales y provee distribución de tamaños. El número de células contadas por muestra es aproximadamente 100 veces mayor que los recuentos microscópicos, reduciendo el error estadístico aproximadamente 10 veces”


- El Coulter Counter Model S fue el primer instrumento que de manera automática procesó datos multiparamétricos en sangre.
- El número de pulsos eléctricos indica la cantidad de partículas que pasan a través de la apertura y el tamaño de los pulsos es proporcional al volumen de las partículas.
- Los contadores modernos aún siguen usando este método, el cual es el método de referencia para recuentos de células
- Los contadores COULTER realizan este recuento por triplicado para eritrocitos, leucocitos y plaquetas
- Este sistema es actualmente el método de referencia para el recuento de células y es usado por todos los fabricantes de contadores celulares

Algunas limitaciones del Método

Las limitaciones de este método están relacionadas con los tipos de partículas a medir, como condición básica las partículas en estudio deben ser menos conductoras de electricidad que el medio en que están disueltas, el tamaño de las partículas a medir debe estar entre el 2 y el 60 % del diámetro de la apertura.

¿Cómo se diferencian los Eritrocitos, Leucocitos y Plaquetas?

Los sistemas COULTER poseen 2 baños, uno de eritrocitos y otro de leucocitos, en el baño de eritrocitos se encuentra una apertura de 50 µm y en el de los leucocitos otra de 100 µm.

En cada apertura se realizan 3 recuentos de 4 segundos y se obtiene el promedio (en el caso de STKS y GEN-S, estos poseen 3 aperturas de eritrocitos y 3 de leucocitos por lo que la lectura sólo dura 4 segundos y se obtiene el promedio de las 3 aperturas)

En el baño de los eritrocitos el sistema identifica los eritrocitos como aquellas partículas que poseen un volumen igual o mayor que 36 fL (femtolitro), en este mismo baño se realiza el recuento de plaquetas las cuales tienen un volumen entre 2 y 20 fL, en los contadores COULTER si existe un recuento pequeño de plaquetas, el tiempo de recuento se extiende por 4 segundos más, a fin de tener un mayor valor estadístico.

En el baño de leucocitos posterior a la dilución con diluyente isotónico, se aplica agente lisante, el cual destruye la membrana citoplasmática de eritrocitos y leucocitos, permaneciendo los núcleos intactos. Es así que las partículas que midan 35 fL o más son contadas como leucocitos. Hay que hacer notar que los núcleos de eritroblastos si existiesen también son contados, por lo que si el instrumento señala sospecha de su presencia se deben buscar en el frotis y de tener un número considerable, se debe corregir el recuento de leucocitos.

Posterior al recuento de leucocitos y utilizando la reacción química del lisante con la hemoglobina libre en la mezcla, se mide un complejo químico estable a 525 nm, el cual dependiendo del instrumento, puede ser realizado en el mismo baño o en una cubeta de flujo especialmente diseñada.

Consecuentemente los parámetros medidos son: Eritrocitos (RBC), Leucocitos (WBC), Plaquetas (PLT) y Hemoglobina (Hb).

Los parámetros derivados de las mediciones de volumen: Volumen corpuscular medio (VCM), Ancho de distribución eritrocitaria (ADE) y Volumen plaquetario medio (VPM)
Los parámetros calculados son: Hematocrito (Hct), Hemoglobina corpuscular media (HCM) y concentración corpuscular media (CHCM)

¿Como se obtienen los histogramas de leucocitos, eritrocitos y plaquetas?

Como se mencionaba anteriormente el analizador mantiene una estadística de los volúmenes celulares, y luego realiza una distribución de cantidad relativa versus volumen de estas tres poblaciones, la separación de volúmenes se hace con una resolución de 256 canales para cada parámetro.

¿Por qué los recuentos de plaquetas de los instrumentos COULTER son más reproducibles y exactos?

- Si el recuento en el tiempo predefinido de lectura (4 segundos) es muy bajo, el analizador cuenta por otros 4 segundos más
- Como comprobación y a fin de detectar posibles cúmulos plaquetarios, los instrumentos COULTER, utilizando el método de los cuadrados menores y ajustan la curva de distribución a log normal y se verifica que la curva sea positiva, que la moda de los tamaños de las plaquetas este entre 3 y 15 fL y el ancho de distribución plaquetaria sea menos de 20%, si alguno de estos criterios no se cumple, se informa una alarma.
- COULTER utiliza su tecnología patentada de SWEET FLOW que consiste en hacer circular una corriente de diluyente en la parte inmediatamente posterior de la apertura de eritrocitos, a fin de que las plaquetas como son tan pequeñas no permanezcan en el área de recuento y por lo tanto no se cuenten más de una vez.


Práctica Nº 10
TIEMPO DE SANGRIA

Mide el tiempo que tarda en detenerse la salida de la sangre, provocada por una lesión estandarizada, realizada en los pequeños vasos superficiales.
Es la medida de efectividad de la hemostasia de los pequeños vasos, tradicionalmente Interpretada como dependiente de la interacción plaqueta-pared vascular.
Técnica de Duke:
Limpiar el lóbulo de la oreja con la torunda de alcohol.
Se practica una pequeña incisión en el lóbulo de la oreja o pulpejo del dedo con una lanceta descartable a una profundidad de 1-3 mm.
Cuando aparece la primera gota de sangre, secarla con papel filtro.
Comenzar a secar con el papel filtro a intervalo de medio minuto hasta que se detenga la hemorragia.
Controlar el tiempo y anotar el resultado.
Valores normales:
Hasta 5 minutos.
Resultados anormales: alargados.
El tiempo prolongado de sangría implica con un recuento plaquetário sugiere disfunción plaquetário. El TS esta aumentado en trombocitopénias, trombopatías, uremias, mielomas, déficit de fibrinógeno.

Práctica Nº 11
TIEMPO DE COAGULACION
Determinar el tiempo que tarda la sangre para ser coagulada, mide la vía intrínseca. El tiempo de coagulación es el tiempo que requiere la sangre venosa en coagular, en ausencia de factores tisulares. También para detectar deficiencias graves de los factores de la coagulación.
El tiempo de coagulación es la prueba de las diátesis hemorrágicas plasmática .indica el estado de los factores plasmático que intervienen en el mecanismo de la coagulación o que la dificultan, aunque hay que resaltar su escaso valor.
Esta técnica debe ser reemplazada por el tiempo de recalcificación y que es de muy bala sensibilidad y especificidad.
Método de Lee - White:
Materiales y equipos:
Ø Tubos de ensayo (de 75x10 mm de vidrio).
Ø Material para venopunción.
Ø Baño termorregulador o BM a 37oC.
Ø Cronómetro.
Procedimiento:
Extraer mediante una jeringa de aproximadamente 2ml de sangre venosa, ponga en funcionamiento el cronometro desde el momento en que la sangre fluye por la jeringa.
Llene los dos tubos con aproximadamente 1ml de sangre.
Coloque los tubos en el baño Maria a 37ºC.
Después de tres minutos saque el primer tubo del baño. Incline el tubo hasta un plano de 45º, para observar si la sangre se ha coagulado.
Si la sangre no a coagulado de nuevo el tubo al baño y examínelos cada 30 segundos hasta que coagule.
Examine el segundo tubo después que coagulo el primer tubo.
Detenga el cronometro y tome nota del tiempo transcurrido.
Esta pruebe es más confiable, si los tubos se mantienen a 37oC hasta que ocurra la coagulación. El TC se prolonga por tratamiento anticoagulante, agitación del tubo o:

Valor de referencia: 5 a 10 minutos.

Valores críticos: Mayor a 15 minutos.

Práctica Nº 12
RETRACCIÓN DEL COÁGULO
Cuando se deja coagular en forma espontánea la sangre total se obtiene una masa sólida con todos los componentes sanguíneos. Con el tiempo el coagulo reduce su masa y exuda suero, por la función retráctil de las plaquetas sobre la red de fibrina.
La retracción del coagula se inicia ya en la primera hora de la extracción hemática y es total a las 3 o 4 h. Normalmente el volumen del coagulo retraído en relación al suero representa alrededor del 55% del volumen inicial de la sangre extraída.

Fundamento:
La observación de un coagulo formado en un tubo de ensayo de base cónico, proporciona información sobre:
La concertación de fibrinógeno.
El número y calidad de la función de las plaquetas.
La actividad del sistema fibrinolítico (fibrina factor XIII) conteniendo en el plasma.


Procedimiento:
Extraer sangre sin anticoagulante.
Colocar en un tubo de vidrio milimetrado, con base en cono, 5 ml de la muestra.
Dejar en B. Maria a 37 ºC., se controla una vez que que se observe el coagulo.
Se activa el cronómetro 1 h.
Se mide el volumen total de la muestra.
A la hora se retirar el coagulo se mide el volumen del suero remanente.
Calculo del resultado:
Vol. del suero remanente
--------------------------------- x 100 = %
Vol. total de la muestra.
Otros factores incluyen aunque no en menor grado son la concentración de fibrinógeno y la masa de hematíes de modo que si el fibrinógeno es deficiente o existe poliglobulia, las mallas de fibrina son débiles para abarcar todos los hematíe y la retracción del coagulo es escasa.
Factores que interfieren:
Es deficiente la retracción del coagulo:

En las trombopenias y en las tromboastenias
En las disminuciones importantes del fibrinógeno
En las poliglobulias acentuadas por desproporción del retículo de fibrina respecto a la masa celular
En las reducciones del factor estabilizante de la fibrina congénita o adquirida (cirrosis hepática o neoplasia).
Valores normales:
Permitido hasta más del 40 a 60 %

Práctica Nº 13
TIEMPO DE PROTOMBINA.

Método de Quick.

La protrombina es una glucoproteína dependiente de vitamina K que se produce en el hígado y que es necesario para la formación de un coagulo firme de fibrina. Se convierte en trombina en la cascada de la coagulación, y no debe aparecer en el suero después de la formación del coágulo.

Se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular el plasma descalcificado, determinar la actividad protrombinica del plasma, para explorar la coagulación de la vía extrínseca.

El tiempo de protrombina es un tiempo de coagulación en condiciones especiales: se ha hecho incoagulable la sangre con citrato y el plasma así preparado se recalcifica y se le añade exceso de tromboplastina mística con lo que la coagulación depende de la presencia de los activadores del sistema extrínseco: factores V, X, VII y del fibrinógeno. Finalidad es detectar deficiencias de del sistema de coagulación extrínseco.
Procedimiento:
Material y reactivo:
Ø Tubos de hemólisis.
Ø Pipetas y micropipetas capaces de medir los volúmenes requeridos.
Ø BM a 37oC.
Ø Fuente luminosa.
Ø Centrifuga.
Ø Vial contenido de preparación liofilizada de tromboplastina de cerebro de conejo deshidratado en acetona, calcio tampón, un antimicrobiano y estabilizante. Conservar a 2 – 8 oC.
Ø Agua destilada o liofilizada.
Ø Pool de plasma control ó controles comerciales.
Reconstituir el reactivo con volumen de agua destilada señalada en la etiqueta del frasco y conservar, en refrigerador a 2 – 8 oC. Ejemplo Reactivo de la línea Tromboplastina-C Plus, Dade con 4 ml de agua destilada agitar antes de usar, el reactivo es estable 8 h. es estable a 37oC, 24h. entre 15 y 25oC, 5 días entre 2 y 5oC.

Utilizar anticoagulante citrato al 3,8%, en una relación 1 a 9 de sangre.

Precalentar el reactivo previamente preparado a 37º:
Ø Realizar la separación del plasma en las dos primeras horas de haber tomado la muestra y se debe procesar máximo las primeras 4 h.
Ø Se debe realizar la prueba por duplicado, la diferencia de ambos valores no debe ser mayor al 10% de otro modo debe repetirse.
Ø Centrifugar la muestra para obtener el plasma 15 minutos 3.000r.p.m. para obtener plasma pobre en plaquetas.
Ø El pH de la reacción debe estar entre 7,2 a 7,4
Ø Pipetear en tubos de coagulación los siguientes: 100µl de muestra (sangre citratada) y 100µl del control.
Ø Incubar los tubos durante 1 a 2 minutos a 37oC.
Ø Añadir vigorozamente tromboplastina reactivo precalentado 200µl o 0,2ml.
Ø Empezar a cronometrar simultáneamente a la adición de tromboplastina sobre el plasma, con la ayuda del gancho metálico y cerca de una lámpara de luz verificar la presencia del coágulo formado, momento que se detiene el cronómetro.
Ø Observar el tiempo de formación del coagulo.
Factores que interfieren:

Exceso de anticoagulante.

Presencia de coagulo en la muestra Hemólisis de la muestra.


Valores normales:

Varia entre 11 y 13 segundo. (12seg.).

Resultados anormales: alargados.

Valores mayores a 13 segundos

Práctica Nº 14
TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (APTT).

El APTT es un prueba sensible a deficiencia de agente pro coagulante del plasma, así como a la presencia de ciertos inhibidores de la coagulación.

Sirve par detectar anormalidades en la vía intrínseca de la coagulación, como son los factores necesario para la formación del activador del intrínseco de la protrombina, o sea los factores XXII, XI, IX, VIII. También detecta deficiencia severa de los factores X, V, II, I, no siendo con los factores plaquetarios, la deficiencia de los factores VII y XIII, ni los problemas vasculares. También permite la identificación rápido de hemofílicos en potencia.

Se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado en un BM a 37oC y en presencia de un exceso de cefalina de cerebro, activador (caolín sustancia inerte cargado negativamente) y calcio (clorura de calcio 0.025 mmol/l M)

Procedimiento:
Se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado en un BM a 37oC y en presencia de un exceso de cefalina de cerebro, activador (caolín sustancia inerte cargado negativamente) y calcio (clorura de calcio 0.025 mmol/l M).
v Obtener 4.5 ml de sangre y colocarla en un tubo que contiene 0,5 ml de citrato de sodio 3.8% como anticoagulante. O la relación 1 a 9 de sangre.
v Mezclar y centrifugar y separar el plasma.
v Precalentar el cloruro de calcio a 37 ºC.
v Colocar en un tubo de hemólisis: plasma 100µl y reactivo APTT 100µl.
v Mezclar e incubar 3 a 5 minutos a 37 ºC luego agregar cloruro de calcio a 37 ºC 100µl.
v Disparar simultáneamente el cronometro. Agitar brevemente para homogenizar el contenido, mantener en el baño 25 seg. luego sacar el tubo del baño e inclinar suavemente 1 vez por segundo, y detener el cronometro en el momento de la formación del coagulo.
Factores que interfieren:
v Presencia de coagulo en la muestra.
v Muestra hemolizada.
v Exceso de reactivos.
Valores normales:

Se informa como APTT en seg. Cuyo valor normal o referencia oscila entre 22 a 37 seg.
Posibles valores críticos:

Valores que difieran mas 6 segundo de un plasma control lo que ocurre si algunos de los factores esta por debajo de 15 a 20% de su concentración normal.

Resultados anormales:

Es recomendable que cada laboratorio procese un plasma control con cada lote de reactivo empleado y que correlacione los valores obtenido para el paciente con el dicho plasma, haciendo constar estos resultados en el informe.


Práctica Nº 15
RECUENTO DE RETICULOCITOS
Se origina por maduración del eritroblasto ortocromático. Éste es un eritrocito joven que todavía contiene un fino retículo basófilo que se demuestra con tinciones supravitales como azul de cresil brillante. Coloreadas con cualquiera de los métodos de Romanowsky, estas células exhiben una basofília pálida difusa. Presenta la siguiente morfología:
v Es algo mayor que el hematíe (8 – 9 µ de diámetros).
v No tiene núcleo.
v Su citoplasma, al poseer todavía alguna cantidad de ARN, conserva cierta tonalidad azulada. Contiene algo de sustancia ribosómica y reticular que es visible mediante la tinción vital de azul cresil brillante, y que se conoce como red granulofilamentosa.
Aún es capaz de sintetizar Hb.
Permanece de 2 a 4 días en la médula ósea y un día en sangre periférica, hasta terminar de madurar. Estas células son planas y diciforme, a medida que pierde su retículo basófilo se convierte en un glóbulo rojo maduro o eritrocito.
En condiciones normales, constituye del 0,5 - 1,5 % del total de hematíes circulantes
Recuento de Reticulocitos.-
El objetivo es recontar los reticulocitos por el método directo (método húmedo), para evaluar el grado de producción de los GR.
El azul cresil brillante es un colorante supravital, tiñe el RNA residual (precipitando los GR inmaduros). Se cuenta los glóbulos rojos con retículo teñido y el resultado se expresa como porcentaje del número de glóbulos rojos examinados.
Material a utilizar:
Tubos de hemólisis, porta objetos (desengrasados), micropipetas y punteras, BM 37oC.
Reactivo a utilizar:
Azul cresil brillante…………….1 g.
NaCl al 0.9 %...........................100 ml.
Citrato de Na……………………0.4 g.
Para la preparación del colorante, se disuelve el azul cresil brillante en la solución de ClNa, para luego agregar el citrato de sodio.
Procedimiento:
v Se colocan 50 microlitros de sangre del paciente en un tubo de hemólisis, luego se agregan 50 microlitros de azul cresil brillante.
v Se mezclan bien y se incuban 15 minutos a 37ºC.
v Se prepara el frotis por duplicado y se deja secar.
v Examinar el frotis con objetivo a inmersión en aceite-Observar los2 frotis, se observan 10 campos microscópico. En cada campo debe haber +/-100 glóbulos rojos realizándose el recuento total en 1000 glóbulos rojos.
Cálculo:
R = No de Retic . x 100 = (%)
1000 GR examina.
Factores que interfieren:
La hemólisis, uso inadecuado de anticoagulante en cantidades excesivas, mala homogeneización de la muestra, mal el lavado de material.
Valores normales:
0.5 – 2.0 %


Práctica Nº 16
TIPIFICACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO

Los grupos sanguíneos humanos, son sistemas de antígenos presentes en las membranas de eritrocitos y otras células del organismo, que se heredan independientemente uno de otro, de acuerdo con leyes mendelianas simples.

A las propiedades antigénicas de membrana, se oponen otras séricas, los anticuerpos específicos existentes naturalmente o luego de la inmunización con un antígeno extraño.

El determinar el grupo sanguíneo de las personas es importante para diferenciar los distintos grupo sanguíneo debido que puede producirse reacciones hemolíticas se transfundimos hematíes en receptores que posean los correspondientes anticuerpos en su circulación. Los grupos sanguíneos ABO y Rh son de importancia primordial en la patogenias de las reaciones hemolíticas transfusionales y en la eritroblastosis fetal.

Antígeno de grupo:
Son las sustancias de membrana que dan el carácter distintivo de un determinado grupo sanguíneo, en un sistema dado. Sólo se conoce con cierta exactitud la estructura química de los antígenos del sistema ABO, Lewis, YMN. Se piensa que en todos los casos son moléculas complejas de alto peso molecular, ricas en ácido sálico.
La mayor parte de los antígenos de grupo, ya se expresan en los precursores del glóbulo rojo adulto. Igualmente, muchos son detestables en los eritrocitos del recién nacido. Otros en cambio aparecen plenamente expresados al año de vida o más tarde.

Anticuerpos de grupo:
Son sustancias (inmunoglobulinas M ó G) que específicamente reaccionan con un determinado antígeno de membrana. Se distinguen dos tipos de anticuerpos: naturales y adquiridos.

Anticuerpos naturales. (aglutininas completas o bivalentes), presentes en el plasma de un sujeto, sin contacto previo con el antígeno. Los más conocidos son los anticuerpos del sistema ABO, aunque se han descrito en otros sistemas.

La mayor parte de los anticuerpos naturales son IgM de alto peso molecular, no atraviesan la placenta, su temperatura óptima de reacción es de 4-25º C. Frente al antígeno eritrocitario dan lugar a una reacción de aglutinación. Dos teorías tratan de explicar su origen:

v Su producción es consecuencia de la ausencia del antígeno contra el cual reacciona.
v Son heteroanticuerpos que surgen como respuesta inmunológica del huésped, a sustancias antigénicamente similares a las que caracterizan a un determinado grupo sanguíneo. Así se conocen sustancias de origen bacteriano y vegetal de composición química semejante a la de ciertos antígenos de grupo.

Anticuerpos adquiridos o inmunes. (Incompletos ó univalentes), presentes en el plasma de un sujeto que tuvo contacto previo con el antígeno, para el cual son específicos.

La mayor parte de los anticuerpos adquiridos, son IgG, aunque en algunos sistemas como el ABO, el tipo de anticuerpo sintetizado, parece depender del grupo sanguíneo del sujeto receptor. Los anticuerpos IgG son de bajo peso molecular, atraviesan la placenta, no fijan el complemento, reaccionan mejor a 37º C y en presencia solamente del antígeno, no dan lugar a una reacción de aglutinación.

Los anticuerpos inmunes de tipo IgG, son muy persistentes y se detectan niveles séricos elevados varios años después de la sensibilización.

Cuando se mezclan suero y glóbulos de distintas personas, puede ocurrir que tales mezclas permanezcan homogéneas, ó bien, que aparezca aglutinación. Este fenómeno observado primero por Landsteiner, permitió asentar el concepto de compatibilidad sanguínea, tan importante en la práctica de las trasfusiones.

La aglutinación se produce por la actuación de los anticuerpos (Acs), del suero de las aglutininas sobre los antígenos (Ags), de estroma de los hematíes o aglutinógenos.

El determinar el grupo sanguíneo de las personas es importante para diferenciar los distintos grupo sanguíneo debido que puede producirse reacciones hemolíticas se transfundimos hematíes en receptores que posean los correspondientes anticuerpos en su circulación.

Los grupos sanguíneos ABO y Rh son de importancia primordial en la patogenias de las reacciones hemolíticas transfusionales y en la eritroblastosis fetal.

Según las últimas instrucciones se procede por duplicado, de la siguiente manera:
v Para cada muestra, realizar una determinación directa.
v En un portaobjeto depositar 20 microlitos de muestra en cada extremo de la lamina y en otra lamina depositar 20 microlitos.
v Depositar una gota de cada reactivo anti A, anti B, anti D.
v Mezclar bien y esperar hasta 2 minutos.
v La segunda vez se lo realiza el lavado, realizar el lavado con soluciòn fisiológica.
v En un tubo de hemólisis añadir unos 200 microlitros de muestra, unos 3ml de solfis
v Centrifugar a 3000 r.p.m. durante, hasta 30 segundos, o a 100r.p.m. durante 1 minuto.
v El sobrenadante desechar, añadir unos 3 ml de solfis repetir 3 veces esta operación.
v Después de la tercera centrifugada desechar el sobrenadante, en 3 tubos previamente rotulado añadir los GR lavados 20 microlitos a cada uno, al (A. B, D)
v Añadir los reactivos correspondiente y llevar a centrifugar a la velocidad y tiempo indicado anteriormente.
Resultado:
· Ver si hay aglutinación indica positivo.
· No existe aglutinación (homogénea) negativo.

Práctica Nº 17
Preparación de la gota gruesa y frotis fino de sangre:

Método- Coloque una gota de sangre en el centro de una lámina limpia. Con la esquina de una segunda lámina riegue la gota hasta que adquiera el tamaño de una moneda de cinco centavos. El espesor debe ser tal que permita ver apenas la impresión del periódico a través de la lámina. Los frotis finos se hacen de manera estándar. Permita que los preparados se sequen.

Cuando las películas estén secas, fije y coloree el frotis fino de la manera convencional pero cuide que el pH del colorante este ligeramente alcalino, se recomienda (pH 7.2). Un colorante ácido puede que no muestre los parásitos. La gota gruesa se colorea mejor usando colorante de Giemsa diluido (1/20). Utilice una jarra de coplin para que el frotis se mantenga en posición vertical. Esto permite que cualquier escombro caiga al fondo de la jarra. No fije la muestra antes de colorearse. Coloree por unos 30 minutos, lávese suavemente y deje que se seque. Si lo tiene, utilice un control positivo.

Bajo el microscopio examine la gota gruesa primero. Use el lente de inmersión en aceite o el lente de alto aumento para determinar si los parásitos están presentes. Tome nota del número de plaquetas y de leucocitos en el paciente. La malaria usualmente se asocia a un número de leucocitos normales o reducidos. Leucocitosis solo ocurre en casos terminales. El número de plaquetas se reduce en forma moderada o severa en aproximadamente un 80% de los pacientes con malaria. Los parásitos pueden aparecer distorsionados si el paciente ha sido tratado o ha recibido profilaxis inadecuada.

PRACTICA Nº 18
Recuento diferencial de leucocitos o formula leucocitaria


Objetivo: Realizar un recuento porcentual de los diferentes tipos de leucocitos que circulan por la sangre.

Antecedentes: En condiciones normales el recuento diferencial de leucocitos está constituido por cinco poblaciones de leucocitos: neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos.

Los neutrófilos son en su gran mayoría segmentados o polimorfonucleares y en una pequeña proporción no segmentados o bandas. Desde que fueron perfeccionados los procedimientos de tinción de la extensión sanguínea, la fórmula leucocitaria se ha venido realizando mediante observación microscópica y análisis de 100 ó 200 células por cada recuento diferencial.

La fabricación de instrumentos automáticos capaces de analizar un número superior de células (10.000 a 30.000) en mucho menos tiempo, ha permitido obtener recuentos de manera más rápida, fiable a menor costo.

Fundamento: Consiste en determinar el porcentaje de cada tipo de leucocitos, por observación directa al microscopio, contando todos los encontrados hasta llegar a 100 ó 200 leucocitos dispuestos en un extendido de sangre adecuadamente teñido, con la finalidad de obtener información sobre aspectos cualitativos y cuantitativos de los diferentes leucocitos de la sangre, así como detectar la eventual presencia de células anormales circulantes.


Material:

- Extensión sanguínea teñida
- Aceite de inmersión
- Microscopio con objetivo de inmersión
- Registrador de células, que es un teclado con teclas diferentes y con marcadores independientes para cada tipo de leucocitos. Cuando la suma total llega a cien suena un aviso o deja de hacer anotaciones.

Técnica:

1. Una vez seco el extendido de sangre, se lleva a observación microscópica, con objetivo de menor aumento 10 x a nivel del cuerpo hacia la cola.
2. Cambiar de objetivo a 100 x, con aceite de inmersión, observándose tres tipos de células diferentes entre si, tanto desde el punto de vista estructural como funcional: células nucleadas (leucocitos) con función de defensa, células anucleadas (eritrocitos) con función respiratoria y fragmentos citoplasmáticos (plaquetas) con función hemostática.
3. Se inicia el recuento diferencial. Para evitar contar dos veces un mismo área se debe seguir un recorrido en forma festoneada.
4. Se van contando los distintos tipos de leucocitos y se clasifican morfológicamente en el registrador celular. Si se carece de contador de células, la anotación puede realizarse en un papel, diferenciando los diferentes tipos celulares. Se anotan las abreviaturas de las células antes descritas y a su lado se anotan palotes en grupos de cinco o diez, de manera que faciliten la suma total de los leucocitos.

Leucocitos:

Los leucocitos o glóbulos blancos se caracterizan por presentar núcleo y organelas citoplasmáticas, lo que permite su diferenciación de eritroblastos y plaquetas. Se han clasificado en dos grupos: a) polimorfonucleares, con núcleo lobulado y de apariencia múltiple: neutrófilos, basófilos y eosinófilos y b) mononucleares, con un núcleo único y redondeado, situado generalmente en el centro de la célula: linfocitos y monocitos.


Valores de referencia de la fórmula leucocitaria e interpretación de sus alteraciones patológicas:

La fórmula leucocitaria tiene dos objetivos: a) medir la concentración en la sangre de neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos y, b) indicar posibles alteraciones como la presencia de células que no suelen presentarse en sangre periférica (blastos, mielocitos, eritroblastos y otras), o el aumento de alguna subpoblación leucocitaria normal (bandas, células linfoides reactivas, monocitos, etc.) que indican patología. Existen por tanto variaciones cualitativas y cuantitativas de la fórmula leucocitaria.

Alteraciones cuantitativas: Pueden ser: aumento de una subpoblación de leucocitos, disminución de una subpoblación de leucocitos y presencia de células inmaduras o blastos.

Aumento de una subpoblación de leucocitos:

Neutrofilia: Aumento de los neutrófilos por encima de 65 % o superior a 7,5 x 10 9 / L, entre las causas están las infecciones bacterianas, síndromes mieloproliferativos, síndromes inflamatorios agudos y crónicos, infartos y necrosis hísticas, enfermedades metabólicas, medicamentos o sustancias químicas.

Eosinofilia: Aumento de los eosinófilos por encima de 3 % o superior a 0,5 x10 9 / L, entre las causas están las enfermedades alérgicas y autoinmunes, parasitosis, ingesta de medicamentos, enfermedades de la piel, infecciones, eosinofilia pulmonar, síndrome hipereosinófilo, neoplasias, endocrinopatías.

Basofilia: Aumento de basófilos por encima de 1% o mayor a 0,5 x10 9 / L, entre las causas, se encuentran el fenómeno reaccional, síndromes mieloproliferativos crónicos, otras causas como anemia ferropénica hemólisis, cirrosis, esplenectomía, viruela, varicela.

Linfocitosis: Aumento de linfocitos por encima de 35 % o superior a 4,5 x10 9 /L, entre las causas se encuentran la linfocitosis fisiológica de la infancia, infecciones como la tos ferina, rubéola, varicela, influenza, hepatitis A, brucelosis, tuberculosis, sífilis, infección por VIH, leucemia linfática crónica. Es necesario diferenciar si se trata de linfocitosis absoluta.

Monocitosis: Igual que en el caso de la linfocitosis, sólo debe considerarse la existencia de una monocitosis real cuando la cifra absoluta de monocitos es superior a 0,8 x 10 9 / L, entre las causas se encuentran: la monocitosis fisiológica del recién nacido, infecciones bacterianas crónicas y granulomatosas, enfermedad de Hodkin, enfermedades reumáticas y autoinmunes, hemopatías, destrucción de tejidos, fase de recuperación medular.
Disminución de una subpoblación de leucocitos:

Neutropenia: Es la disminución de neutrófilos por debajo de 25 % o inferior a 2,5 x 10 9 /L, la neutropenia suele cursar con una disminución de la cifra total de leucocitos (leucopenia). Entre las causa se encuentran ingesta de algunos medicamentos, enfermedades reumáticas y autoinmunes, infecciones virales, salmonelosis, neutropenia crónica idiopática, enfermedades hematológicas, tratamiento con citostáticos.

Linfopenia: Es la disminución de linfocitos por debajo de 1,5 x 10 9 /L. en general existe linfopenia, en todo caso de leucopenia grave, independientemente de su origen. Se observa linfopenia absoluta en el curso de la insuficiencia cardiaca congestiva, en el curso del SIDA por VIH.
Eosinofilopenia y basofilopenia: Suelen asociarse a trastornos metabólicos y endocrinos.

Presencia de células inmaduras o blastos: El paso a la sangre de células inmaduras, normalmente presentes sólo en la médula ósea, es siempre patológico y puede hacerse de tres formas diferentes: mielemia (presencia de mielocitos y metamielocitos), eritroblastosis (presencia de elementos inmaduros de la serie eritroide) y presencia de blastos (presencia de elementos muy inmaduros como en la leucemia aguda o células linfoides en diferentes estadios madurativos como en el linfoma leucemizado.

Alteraciones cualitativas: Al realizar una fórmula leucocitaria, debe tenerse en cuenta la posible presencia de alteraciones morfológicas de las cuales normalmente presentes en la sangre periférica y que pueden ser de valor en el diagnóstico clínico.

Polimorfonucleares neutrófilos

Alteraciones de la granulación: Puede observarse granulaciones tóxicas o exceso de granulación primaria (lisosomas que muestran abundante y desgranulación o disminución de la granulación secundaria), cuerpos de Döhle (inclusiones ovaladas que se sitúan hacia la periferia del citoplasma del polimorfonuclear neutrófilo), las anomalías de Chediack-Higashi (aparición de inclusiones citoplasmáticas, de color azul oscuro, generalmente rodeadas por un halo).

Alteraciones del núcleo: Desviación a la derecha (neutrófilo hipersegmentado con 5 o más lóbulos y de mayor tamaño), se observa especialmente en anemia megaloblástica. Desviación a la izquierda (disminución del número de neutrófilos con segmentación normal, a expensas de un aumento del número de neutrófilos no segmentados o cayados.

Linfocitos: Pueden observarse Virocitos o linfocitos estimulados en el curso de ciertas infecciones víricas, son linfocitos con un citoplasma abundante e intensamente basófilo.

Monocitos: En algunas circunstancias patológicas resulta difícil diferenciar un monocito de un linfocito estimulado, o un neutrófilo no segmentado de un metamielocito desgranulado o de un monocito.

Plaquetas y eritrocitos: La realización de la fórmula leucocitaria, además de permitir apreciar las características morfológicas de los leucocitos, permite observar simultáneamente la morfología de las plaquetas y eritrocitos. En el frotis se puede realizar una estimación cuantitativa de las plaquetas que presentan tamaños variables entre 3 a 5 um y su número puede aumentar después de una hemorragia o en la anemia ferropénica. En ciertas hemopatías (mielofibrosis y trombocitopenia
Cuestionario

1.¿Cuál es la diferencia entre el plasma y el suero?
2.¿Cuál es la función de los glóbulos rojos?
3.¿Cuál es la función de los glóbulos blancos?
4.¿Cuál es la función de las plaquetas?
5.¿Cuáles son los factores que interfieren en la determinación del hematocrito?
6.Describa el fundamento, para la determinación de hemoglobina
7.Con los siguientes datos:
Factor: 37.96
Transmitancia de la muestra: 40%
Calcular la concentración de hemoglobina en g/dl
8.¿Qué nos permiten conocer los índices hematimétricos, describa de cada uno de ellos (VCM, HCM, CHCM)?
9.¿Cuáles son los factores que interfieren en la determinación de la eritrosedimentación?
10.¿Cuál es la dilución empleada para el recuento de glóbulos blancos y mencione el fundamento?
11.Describa la fórmula para el calculo del recuento de plaquetas
12.Describa la Técnica de Tinción de May-Grünwald-Giemsa.
13.¿Cual es el valor de referencia para el tiempo de sangría, y el tiempo de coagulación?
14.Describa el procedimiento para la técnica: Retracción del coagulo.
15.¿Qué vía de la coagulación nos permite valorar el tiempo de protrombina(TP) y el de tromboplastina(TTP) respectivamente?
16.¿Qué son los reticulocitos?
17.¿Describir la técnica de grupo sanguineo en tubo?
18.¿Describa un hemograma de un paciente con alguna infección bacteriana y otro con alguna infección viral?

153 comentarios:

  1. Un saludo a todos, comentarles que me encuentro a la espectativa de realizar este curso ya que lo va ha dar el Dr. Zuna y tengo referencias de que sus clases son realmente interesantes.

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  2. como ya ustedes saben que hay que asistir por lo menos 5 veces de manera virtual a la clase o en todo caso al blog para tener acceso a clases teoricas, por tal motivo enseguida les enviare reiteradas veces mis saludos.

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  3. Bueno creo que ya es suficiente con este ultimo mensaje estoy habilitada a la clase sin otro detalle byyyy

    GRACIAS..

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  4. nos vemos despues de clase en mango

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  5. mmmmmm que interesante el modulo,hay mucho por leer

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  6. hola chicos, a estudiar se a dicho!!!

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  7. un saludo a todos los llajwuas ninas de hematologia, especialmente a Zulema nina.

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  8. ANGELICA hola queridos compañeros.........es muy interesante el tema lastima si q los voy abandonar....sigan adelante¡¡les deseo lo mejor

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  9. NINAS SE PASARON,,,,, SON MUCHAS PREGUNTAS¡¡¡¡

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  10. por Dios que manera de preguntar NINAS, que creen que no tengo nada mas que hacer

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  11. hola yo otra vez Ninas realmente que preguntones son..

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  12. para que vean que hematologia es el area mas importante

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  13. ricardo vaca: saludos a los compañeros

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  14. ricardo vaca: el examen es el otro viernes

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  15. y..y..y..y..hay que leer todo esto?????

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  16. ya lo hicieron el cuestionario???' quien me lo presta!!!!! jejejejeje

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  17. bueno nos vemos en clases chicos y chicas no falten :)
    chao

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  18. quisiera saber por que eliminaron las ultimas lineas de la clase teorica

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  19. Les animo a continuar y no abandonar, ya que el beneficio mas que todo resulta personal

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  20. Buen dia, tomar encuenta los fundamentos de las tecnicas

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  21. esta muy largo!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

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  22. que flojera de leer tanto,pero ni modo,espero tengan paciencia para la presentación del cuestionario.chau

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  23. uuuuuuuu pongan algo interesante de comentario, aunque sea un chismesito........

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  24. noooo mentira lo del chisme, nos vemos en clases

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  25. bueno como no vamos a pasar clase este fin de semana vamos tener mas tiempo de estudiar,gracias por su comprensión flojini.chau

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  26. ricardo vaca: falta mucho por estudiar

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  27. ricardo vaca: saludos a walter arancibia costas

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  28. ricardo saludos a walter linera costas

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